전기영동 (Electrophoresis) 세부 내용 (DNA, RNA, SDS-PAGE, 단백질, EtBr)

* Agarose gel 농도와 DNA 크기

 

Agarose gel 농도에 따라 분리할 수 있는 DNA 크기가 다릅니다.

분리할 수 있는 DNA 크기 단위: 200 bp ~ 50 kb

agarose gel 농도가 높을수록(0.3%~2.0% 분리할 수 있는 DNA 크기가 작습니다(50kb~0.1kb).

 

 

* Ethidium bromide (EtBr)

 

DNA 검출에 사용하는 염료입니다.

ds DNA 사이에 정량적으로 들어가 자외선에 의해 주황색 형광을 보입니다.

그래서 전기영동 과정 마지막에 UV조사가 있는 것입니다.

EtBr은 발암물질이므로 반드시 장갑을 사용해야 합니다.

EtBr에 사용했던 tip은 따로 수거하여 폐기해야 합니다.

요즘은 EtBr 대신 GelRed, GelGreen을 사용하는 추세입니다.

이는 독성이 없고 민감도가 높아 핵산 염색에 유용한 형광 염색 시약입니다.

 

 

* Loading buffer

 

전기영동 well에 DNA 시료(PCR 증폭산물)를 넣을 때, loading dye와 섞여서 넣어야 합니다.

Loading buffer에는 sucrose 등 분자량이 큰 물질이 포함되어 있습니다.

이는 DNA가 gel에서 뜨지 않고 gel well 속에 잘 가라앉도록 하는 역할을 합니다.

Xylene cyanol, bromophenol blue도 포함되어 있어서 파란색을 띠며, 전기영동 진행 정도를 눈으로 확인할 수 있습니다.

대개 bromophenol blue가 gel의 2/3정도에 오면 전압을 걸어주던 것을 멈춥니다(대개 100V 20분).

 

 

* Gel이 굳은 후 바로 사용하지 않을 때는 TAE buffer (전기영동 완충액)에 담가 냉장보관해야 합니다.

 

  

 

* RNA 전기영동 (RNA electrophoresis)

 

RNA는 단일가닥이면서 부분적으로 이차구조를 갖는 경우가 많으므로 변성 gel을 이용해야 합니다.

Agarose gel을 만들 때 변성제인 formaldehyde를 넣습니다.

RNA는 불안정합니다. 피부, 실험기구, 주위 환경에 존재하는 RNase에 의해 손상될 수 있습니다.

 

 

* Diethyl pyrocarbonate (DEPC)

 

단백질의 histidine, tyrosine residue에 modification을 일으키는 물질로, RNase를 불활성화합니다.

RNA 분리 및 관련 실험에는 반드시 DEPC가 처리된 시약을 사용해야 합니다.

DEPC는 발암물질로 추정되므로 조심해야 합니다.

 

 

* 단백질 전기영동 (Protein electrophoresis)

 

일반적으로 SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel)를 사용합니다.

DNA는 인산기 때문에 음전하를 띠는 반면, 단백질은 특정한 전하를 띠지 않습니다.

단백질은 구성 아미노산에 따라 양전하 또는 음전하를 띱니다.

따라서 계면활성제인 SDS를 첨가하여 음전하를 띠게 하는 것입니다.

또한 단백질 분자의 다양한 형태도 이동속도에 영향이 있습니다.

따라서 mercaptoethanol을 첨가하여 단백질의 이황화 결합을 파괴하여 입체 구조를 선형 상태로 변성시켜야 합니다.

 

SDS-PAGE는 staking gel, separating gel (농축 gel, 분리 gel)을 사용합니다.

농축 gel에서 단백질 시료가 일렬로 정렬되고, 분리 gel에서 크기에 따라 서로 다른 속도로 이동하면서 분리됩니다.

 

Acrylamide 농도에 따라 분리할 수 있는 단백질의 크기가 다릅니다.

(15%~5%) – (12Kda~210KDa)

 

DNA, RNA 전기영동 때와 달리 bromophenol blue가 gel의 끝까지 올 때까지 전압을 유지합니다.

(DNA, RNA 전기영동에서는 2/3지점까지)

 

* 단백질 전기영동 진행 후, gel을 유리판에서 분리한 후 Coomassie brilliant blue로 염색합니다.

1시간의 염색, 하룻밤의 탈색 시간이 걸립니다.

 

* Acrylamide, bis-acrylamide는 신경독성이 강하므로 장갑과 마스크를 착용해야 합니다.

 

 

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