전기영동 (electrophoresis) 원리 (agarose gel, 아가로즈겔, 우무겔) (단백질, 분리, 모세관, DNA)

전기영동 (electrophoresis, EP)은 전기장 영향 하의 액체매질 내에서 전하를 띤 어떤 크기의 용질 또는 입자의 이동을 뜻한다.

이러한 원리로 전하를 띤 입자를 분리할 때 사용되는 방법이다.

이온화된 용질은 전기영동 시스템 내에서 가지고 있는 전하에 따라 음극 또는 양극으로 이동한다.

그런데, 양전화와 음전하를 모두 가지고 있는 양성전해질 (ampholyte)이 있다.

이는 고유의 등전점 (isoelectric point, pI)보다 산성인 용액에서는 양전하를 띠게 되어 음극으로 이동하고, 고유의 등전점보다 염기성인 용액에서는 음전하를 띠게 되어 양극으로 이동한다.

양성전해질의 대표적인 예로는 단백질과 핵산이 있다.

입자의 이동속도는 각 입자의 하전량과 용매 사이의 마찰저항에 의해 결정된다.

입자의 하전량은 용액의 pH에 의해 결정되며, 마찰저항은 입자량과 입자의 모양으로 결정된다.

입자의 하전량이 클수록, 분자량이 작을수록 이동속도가 빨라진다.

전기영동에서 이온의 이동성에 영향을 주는 요인은 분자의 순하전 (net charge), 분자의 크기와 모양, 전기장의 세기, 매질의 성질, 완충제의 이온강도, 온도 등이다.

전기영동을 임상적으로 응용하는 것은 대표적으로 단백 전기영동 (protein electrophoresis, PEP)이 있다.

혈청, 소변, 뇌척수액 등에서 단백질의 정량적 분석, 헤모글로빈 분획 정량, 단클론단백 검출, 주요 지단백의 분리와 정량에 사용된다.

CK, LDH, ALP 등의 동종효소 (isoenzyme) 분석에도 이용된다.

면역전기영동 (immunoelectrophoresis, IEP), Western blot, Southern blot에도 사용된다.

* 고식적 전기영동 (conventional electrophoresis)

전형적인 전기영동장치는 전원 공급 장치, 완충용액 수조, 전극 지지매질 (support medium), 덮개로 구성되어 있다.

1) 전원 공급 장치

매질의 이온 종류의 이동을 일으키고 전류 또는 전압을 조절하는 역할을 한다.

모세관 시스템은 킬로볼트 (kilovolt) 범주의 전압을 제공할 수 있는 전원 공급 장치를 사용한다.

등전초점조절 (isoelectric focusing, IEF)법에서는 정전류 전원장치 (constant power supply)를 사용하는 것이 좋으며, 임상미생물 분야에서 주로 사용되는 간헐영역겔전기영동 (pulsed-field gen electrophoresis, PFGE)에서는 이동방향에 비해 전기공급의 방향이 주기적으로 바뀌는 전원장치가 필요하다.

2) 완충용액

완충용액의 이온은 전류를 통하게 하고 전기영동이 수행될 때 pH를 정하는 역할을 한다.

따라서 완충용액의 이온은 용질에 걸리는 전하 종류, 용질의 이온화 정도, 용질이 어느 전극 쪽으로 이동할 것인지 결정한다.

완충용액의 이온강도는 하전된 입자 주위의 이온구름 (ionic cloud)의 두께를 결정하고 이동속도 및 전기영동 띠 (band)의 선명도를 결정한다.

이온농도가 높을수록 이온구름이 두꺼워지고 입자의 이동은 저해된다.

혈청 단백질 분리를 위한 전기영동에서는 barbital 또는 tris-boric acid ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 완충용액을 가장 많이 사용한다.

3) 지지매질 (support medium)

지지매질은 단백 분리가 일어나는 매트릭스 (matrix) 역할을 한다.

지지매질의 종류로는 녹말겔 (starch gel), 아세트산셀룰로스 (cellulose acetate), 우무겔 (agarose gel), 폴리아크릴아미드겔 (polyacrylamide gel) 등이 있다.

녹말겔은 전기영동에서 가장 처음 사용된 매질이며 현재는 거의 사용되지 않는다.

아세트산셀룰로스는 전처리 과정이 불편하다.

따라서 거의 우무겔 (agarose gel, 아가로즈겔)로 대체되었다.

우무겔은 agaropectin으로부터 분리된 정제된 중성우무이다.

우무겔은 구멍 크기 (pore size)가 커서 대부분의 단백질이 방해없이 통과하게 되어 전하 대 질량비 (charge-to-mass ratio) 원리로만 분리된다.

우무겔은 단백질에 대한 친화성이 적고 건조 후 명료해지기 때문에 밀도측정법 (densitometry) 사용이 용이하다는 장점이 있다.

폴리아크릴아미드겔은 곧은 사슬모양의 아크릴아미드가 bis-acrylamide와 가교결합된 고분자 중합 매트릭스이다.

폴리아크릴아미드겔은 내열성이 크고 투명하고 강하고 화학적으로 비활성이며 다양한 구멍크기로 만들 수 있다.

분리는 주로 전하 대 질량비 및 분자크기에 따라 이루어지며, 우무겔에 비해 혈청 단백질을 더 자세히 분석할 수 있다.

고식적 전기영동의 종류는 다음과 같다.

1) 평판겔 전기영동 (slab gel electrophoresis)

두께와 상관없이 사각형 겔을 사용하는 경우를 통틀어 말하는 용어이다.

녹말겔, 우무겔, 폴리아크릴아미드겔 모두 사용될 수 있다.

혈청, 뇌척수액의 단백질, DNA, RNA 분절을 분리할 때 가장 기본적으로 사용되는 방법이다.

2) 불연속겔 전기영동 (disc electrophoresis)

평판겔 전기영동보다 해상도를 높이고자 개발한 방법이다.

불연속 (discontinuity)한 특징을 가진 매트릭스가 특징이다.

구성요소와 구멍 크기가 다양한 폴리아크릴아미드 또는 녹말겔을 층층이 겹친 매트릭스를 사용하여, 혈청 단백질을 20개 이상의 분획으로 분리할 수 있어 특히 유전적 변이형 또는 동종효소 검사에 유리하다.

3) 등전초점조절 (isoelectric focusing, IEF)

단백질은 pH에 따라 양이온 또는 음이온을 띠는 아미노산 중합체이다.

단백질의 하전은 용액 내의 pH에 의존하는데, 하전량이 없을 때의 pH를 등전점 (isoelectric point)이라고 하고, 이 때 용해성이 가장 적어 이동하지 않는다.

Electrolyte cell의 음극에 산을 첨가하고 양극에 염기를 첨가하면 pH 경사 (gradient)가 생기고, 여기에 전기를 가하면 등전점에 따라 단백질을 분리할 수 있다.

단백질의 혼합물에서 좁은 범위의 ampholyte를 이용하면 등전점 0.02 pH 단위차의 단백질까지 분리할 수 있다.

혈청 acid phosphatase 동종효소 측정에 유용하다.

뇌척수액 내 oligoclonal immunoglobulin band, creatine kinase (CK) 동종효소, alkaline phosphatase (ALP, AlkP) 동종효소 측정에 이용된다.

4) 간헐영역 겔 전기영동 (pulsed-field gel electrophores,s PFGE)

이 방법에서는 전기를 다른 전극쌍 또는 전극배열에 번갈아 공급하여 두 방향 사이에 전기장이 순환하게 된다.

이를 통해 50 kb 이상의 DNA 분절 등 분자량이 매우 큰 물질도 분리할 수 있다.

이 방법은 다양한 세균주 DNA 형별분석을 통한 역학연구에 많이 사용되는 방법이다.

5) 2차원 전기영동 (two dimensional (2D) electrophoresis)

이는 단백질체학 (proteomics) 연구에 많이 사용된다.

첫 번째 차원의 분리에서는 우무겔 또는 큰 구멍 폴리아미드겔처럼 구멍이 큰 매질을 사용한다.

두 번째 차원의 분리에서는 선형 또는 계단형 (gradient) 형식으로 폴리아크릴아미드겔이 사용된다.

* 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis, CE)

겔 또는 고분자 매질 대신에 모세관을 이용하는 방법이다.

분리시간이 빠르고 미량의 검체로도 분석할 수 있으며 자동화가 용이하다.

혈청 단백질 뿐아니라 무기이온, 아미노산, 유기산, 약물, 비타민, 포르피린 (porphyrin), 탄수화물, 올리고핵산염 (oligonucleotide), 핵산 분절의 분리도 가능하다.

모세관 전기영동 장치의 구조는 고식적 전기영동 장치와 유사하나, 중간에 겔 대신 모세관과 검출기가 있는 것이 차이점이다.

1) 모세관 형식

모세관 전기영동에서 분리칼럼으로 사용되는 모세관은 용융 실리카 (silica, 순수 유리) 바깐쪽에 얇게 폴리아미드가 코팅되어 강도와 유연성이 좋다.

2) 검체 주입구

1~50 nL의 검체가 모세관에 주입된다.

3) 직접 측정

모세관 전기영동에서는 분리된 분석물질이 광학적 정보를 얻을 수 있는 모세관의 한 지점을 지나갈 때 검출 및 측정된다.

광학측정법은 광도법, 굴절률 (refractive index), 형광측정법 (fluorometry)과 같은 전통적 방법이 사용된다.

자외선 광도계 (ultraviolet-visible photometry)도 흔히 사용된다.

Reference

Laboratory medicine 5th ed.

[관련 글]

2017/12/22 - [의학/진단검사의학] - 단백질 (진단검사의학, 임상화학. albumin, CRP, transferrin, haptoglobin 등)

2017/12/22 - [의학/진단검사의학] - 크로마토그래피(chromatography) - 원리, 종류, 측정물질 (진단검사의학, 임상화학)

2018/01/02 - [의학/진단검사의학] - Electrolyte (전해질) 측정 방법 - 이온선택 전극법, 효소법 등