결핵균의 학명은 Mycobacterium tuberculosis입니다.
마이코박테리아는 세포벽에 mycolic acid가 많아서 일반적인 그람 염색 (Gram stain)으로는 염색되지 않습니다.
세포벽에 있는 긴 사슬의 지방산인 mycolic acid를 가진 세균을 염색하기 위해 항산성 염색 (acid fast stain)이 고안되었습니다.
항산성 염색은 세포벽에 납양 (waxy) 물질을 갖는 세균 (마이코박테리아 등)과 강하게 결합하여 산성 탈색제에 저항하는 성질을 이용하는 방법입니다.
이러한 세균을 항산균 (acid fast bacilli, AFB)이라고 합니다. (결핵균이 막대균이라서 bacilli)
항산성 염색을 통해 결핵균, 비결핵 항산균 (nontuberculous mycobacteria, NTM) 등을 관찰할 수 있습니다.
검체 준비 (전처리), 도말 슬라이드 (smear slide) 제작
농축되지 않은 임상 검체로 직접 도말 (smear) 슬라이드를 만들면 안그래도 낮은 항산성 염색의 민감도를 더 낮게 하므로 권장하지 않습니다.
균질화와 오염 제거 (Homonization & decontamination)
객담 등 정상균무리에 의해 오염이 되어 있을 가능성이 높은 검체는 균질화 (homonization) 및 오염 제거 (decontamination) 과정이 필요합니다.
또한 점액소(mucin)가 있으면 항산균 검출이 어려워지며 오염제거제의 성능을 떨어뜨립니다.
따라서 점액소와 세포안에 있는 항산균을 노출시키고, 오염균을 줄이거나 제거하기 위한 액화과정도 필요합니다.
수산화나트륨(sodium hydroxide, NaOH), N-acetyl-L-cysteine (NALC)을 이용합니다.
고농도의 NaOH는 액화와 오염제거 효과는 있지만 오염균 이외에 항산균에도 영향을 미칠 수 있으므로 NALC를 추가하여 객담의 점액을 녹인 후 NaOH로 효과적인 오염제거가 이루어지도록 하는 것이 좋습니다.
강알칼리일수록 오염 제거가 잘 되지만 항산균도 죽이게 될 수 있으므로 최종적인 NaOH 농도가 5~6%를 넘지 않도록 해야 합니다.
NALC, dithiothreitol 등의 액화제를 사용하면 NaOH의 농도를 낮춰서 간접적으로 항산균 검출률을 높일 수 있습니다.
균질화, 오염제거 및 농축이 된 검체로 항산균 도말 (AFB smear)을 시행합니다.
도말 표본은 생물학적 안전상자 (biosafety cabinet)에서 건조시킵니다.
고정 (fixation)을 하기 위해 electric slide warmer (슬라이드 건조기)에서 70도씨 전후로 2시간 건조시킵니다.
또는 공기중에서 건조시킨 후 슬라이드를 버너 불꽃의 푸른 부분에 3~4차례 통과시켜서 고정할 수도 있습니다.
항산성 염색 종류별 방법, 과정
1. Fluorochrome (형광색소) 법 (auromine O (±rhodamine) 사용)
검체를 고정시킨 슬라이드에 형광염색 시약을 얹어서 15분간 염색합니다.
슬라이드를 물로 씻습니다. 너무 많은 물이 남아있지 않도록 흘려보냅니다.
슬라이드에 0.5% acid-alcohol을 얹어서 2분간 탈색시킵니다.
마찬가지로 슬라이드를 물로 씻고, 너무 많은 물이 남아있지 않도록 흘려보냅니다.
대조염색시약으로 potassium permanganate 또는 acridine orange를 슬라이드에 얹어서 2분간 대조염색을 합니다.
(potassium permanganate 염색을 너무 오랜 시간 하면 항산균의 형광이 약해질 수 있습니다.)
이후 다시 한번 슬라이드를 물로 씻어냅니다.
공기중에서 말립니다. 이 때, 빨리 물기를 제거하고 싶다고 흡습지로 물기를 빨아들여서는 안됩니다.
형광현미경으로 먼저 200~250배, 400배에서 관찰합니다.
항산균으로 의심되는 형태가 관찰되면 400~450배 또는 1000배에서 유침으로 관찰합니다.
형광염색한 슬라이드는 유침시켰던 기름을 자일렌으로 제거하면 바로 carbol fuchsin (Kinyoun 또는 Ziehl-Neelsen) 염색을 시행할 수 있습니다.
2. Kinyoun carbol fuchsin 염색
검체를 고정시킨 슬라이드 전체에 Kinyoun's carbol fuchsin 시약을 충분히 얹어서 5분간 염색하고, 슬라이드를 물로 씻습니다.
슬라이드에 3% acid-alcohol을 2분간 얹어서 탈색시킨 후, 슬라이드에서 색이 빠져나오지 않는 것을 확인합니다.
슬라이드를 물로 씻고 물기가 너무 많이 남지 않도록 흘려보냅니다.
대조염색 시약으로 methylene blue 또는 brilliant green을 슬라이드에 충분히 얹어서 2분간 염색합니다.
슬라이드를 물로 씻어내고 공기중에서 말립니다. 이 때, 물기를 빨리 제거하고 싶다고 흡습지로 물기를 빨아들여서는 안됩니다.
광학현미경으로 1000배에서 관찰합니다.
3. Ziehl-Neelsen (hot carbol fuchsin)
열고정한 슬라이드에 carbol fuchsin을 충분히 얹습니다. 이 때 여과지를 사용하면 결정 침착을 줄이고 염색이 슬라이드에 잘 정착됩니다.
슬라이드에서 김이 올라올 때까지 (steaming) 전기염색장치나 분젠 버너로 가열합니다.
5분간 방치합니다. 이 때 도말표본이 마르면 염색약을 추가하지만 다시 가열하지는 않습니다.
위 과정에서 여과지를 사용했으면 집게로 여과지를 제거합니다. 여과지를 폐기한 용기는 고압증기멸균을 해야 합니다.
슬라이드를 물로 씻고, acid-alcohol을 얹어서 2분간 탈색시킵니다.
슬라이드를 다시 씻고 물기가 많이 남지 않도록 흘려보냅니다.
대조시약으로 methylene blue 또는 brilliant green을 얹어서 1~2분간 염색합니다.
슬라이드를 물로 씻고 공기중에서 건조시킵니다.
광학현미경으로 1000배에서 관찰합니다.
<형광염색 (auramine- rhodamine)>
<Kinyoun>
<Ziehl-Neelsen>
검사 결과 해석 및 보고
1. Fluorochrome 형광 염색 (auramine O)
검은색 배경에, (형광현미경 필터에 따라) 노란색 또는 오렌지색의 1~10 μm의 가느다란 간균 (막대균)이 관찰되면 양성입니다.
인공산물 (artifact)도 형광을 낼 수 있으므로 형광이 있느냐 없느냐만 보지 말고 형태도 살펴야 합니다.
음성인 경우 형광이 관찰되지 않습니다.
2. Carbol fuchsin (Kinyoun, Ziehl-Neelsen)
(대조염색에 사용한 시약에 따라) 청색 또는 녹색 배경에 붉게 염색된 1~10 μm의 가느다란 막대균 (간균)이 관찰되면 양성입니다.
붉게 염색되는 막대균이 관찰되지 않으면 음성입니다.
고려사항
1. 항산성 염색은 마이코박테리아에 특이적인 것은 아닙니다.
Nocardia (노카르디아), Rhodococcus, Legionella micdadei 또는 Cryptosporidium의 포자낭, Isospora 외의 microsporidia (미포자충) 등도 다양한 정도로 항산성이 있습니다.
2. 항선성 염색으로는 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)과 비결핵 항산균 (nontuberculous mycobacteria, NTM)을 감별할 수 없습니다.
3. 항산성 염색의 민감도는 20~80%정도로 낮은 편이고 검사자에 따라 민감도가 달라질 수 있습니다.
결핵균 등 천천히 자라는 마이코박테리아는 꾸준하게 항산성을 보입니다.
하지만 신속발육 바이코박테리아는 항산성이 일정하지 않고, 특히 형광염색을 했을 때 더욱 그렇습니다.
4. 배양의 경우 객담 1 mL당 10~100마리의 항산균이 있으면 양성이 나올 수 있습니다 (추정검출한계).
하지만 항산성 염색은 객담 1 mL당 항산균이 5000~10000마리 있어야 양성이 나올 수 있어서 민감도가 낮고, 항산성 염색 음성이어도 감염을 완전히 배제하기는 어렵습니다.
5. 위음성을 가능하면 줄이기 위해 현미경에서 여러 시야를 관찰해야 합니다.
형광현미경 200~250배에서 최소 30 field 관찰해야 합니다.
6. 슬라이드를 취급할 때에는 장갑을 착용해야 합니다.
정도관리
정도관리를 시행해야 하는 경우는 다음과 같습니다.
- 항산성 염색을 시행하는 경우
- 재료, 시약, 배지의 lot number가 바뀌는 경우
- 배지를 검증하려는 경우
양성 정도관리 슬라이드는 M. fortuitum 또는 H37Ra ATCC 25177 표준균주를 사용하여 만듭니다.
음성 정도관리 슬라이드는 주로 대장균을 사용하여 만듭니다.
* Kinyoun carbol fuchsin
- 양성: (대조염색에 따라) 청색 또는 녹색 배경에서 항산균은 적색 또는 자홍색으로 관찰됩니다.
- 음성: (대조염색에 따라) 청색 또는 녹색으로 염색되어 관찰됩니다.
* 형광염색 (auramin O, auramine-rhodamine)
- 양성: 항산균은 (염료에 따라) 노란색 또는 오렌지색으로 염색됩니다. Auramine O만 사용한 경우 녹색으로 염색됩니다.
- 음성: 형광을 띄지 않아 밝게 보이지 않습니다.
[관련 글]
2019/09/05 - [의학/진단검사의학] - 그람 염색 (Gram stain) 방법, 원리, 실험, 판독, 해석
