그람 염색 (Gram stain)은 1884년에 Gram에 의해 고안되었습니다.
현재는 통상적으로 Hucker의 변법을 사용하고 있습니다.
세균은 세포벽의 구조 및 조성에 따라 그람 양성/음성으로 염색됩니다.
펩티도글리칸 (peptidoglycan) 층이 두껍고 teichoic acid가 많은 세균은 그람 염색 과정에서 첫 번째 crystal violet 염색이 알코올로 탈색되지 않아 진한 보라색으로 관찰되며, 이것이 그람 양성 (Gram positive)입니다.
반면에 한 층의 펩티도글리칸 층이 lipopolysaccharide-phospholipid에 결합되어 있는 세균은 알코올에 의해 탈색되어 (crystal violet-iodine 복합체가 씻겨나감) 대조염색 (safranin)이 되어 분홍색~빨간색으로 관찰되며, 이것이 그람 음성 (Gram negative)입니다.
그람 양성 알균
그람 음성 막대균
그람 염색을 통해 세균의 형태, 크기, 그람 염색성을 비교적 간단하게 확인할 수 있습니다.
그람 염색을 통해 감염 원인균을 추정하고 경험적 항균제를 선택하기 위한 정보를 얻을 수 있습니다.
그람 염색은 세균을 분류하고 검체의 질을 평가하는데에도 활용할 수 있습니다.
그람 염색 방법
Hucker 변법을 기준으로 설명합니다.
0. 먼저 세균의 단층 도말 슬라이드를 만들어야 하는데, 세균의 특징을 잘 관찰하기 쉬운 슬라이드를 만들어야 합니다.
무균실험대에서 건조시킨 후 가열하거나 메탄올로 고정합니다.
1. 고정된 도말 검체에 crystal violet 시약을 슬라이드 끝부터 부어서 검체 쪽으로 흘러가도록 얹은 후 30초간 염색합니다. 직접 붓지 않고 이렇게 흘러가게 해야 합니다.
2. 흐르는 물에 슬라이드를 씻습니다. 염색해야 하는 부분에 직접 물을 쏘지 않고 슬라이드 뒷면으로 물을 흘려보내서 염색이 과도하게 씻겨나가지 않도록 합니다.
3. Iodine 용액으로 물기를 씻어내고 슬라이드 위에 iodine용액을 얹은 후 30초 기다립니다.
4. 흐르는 물로 iodine 용액을 씻어냅니다.
5. 슬라이드에 탈색제 (acetone-alcohol 등)를 흘려서 나오는 물이 맑아질 때까지 1~5초 동안 탈색합니다.
6. 흐르는 물로 남은 탈색제를 씻어냅니다.
7. 슬라이드에 대조염색 시약 (safranin)을 얹고 30초 이상 기다립니다.
8. 흐르는 물로 대조염색 시약을 씻어내고 말립니다.
9. 슬라이드를 현미경으로 관찰합니다.
그람 염색 현미경 관찰, 판독, 결과 보고, 해석
1. 먼저 현미경 저배율에서 적혈구, 백혈구, 기생충, 진균 균사, 괴사조직 파편 등이 있는지 확인합니다.
2. 고배율에서 그람염색성, 염색의 특징, 세균의 형태, 크기, 특징적인 배열 양상 등을 관찰합니다.
- 그람 양성: 진한 보라색
- 그람 음성: 분홍색~빨간색
- 그람 variable: 같은 형태의 균이 그람 양성과 음성을 모두 보이는 경우
- 그람 neutral: crystal violet (진한 보라색), 대조염색 (safranin: 분홍색~빨간색) 모두 염색되지 않는 경우
3. 세균이 관찰되지 않는 경우: No organisms seen
세포가 관찰되지 않는 경우: No cells seen
4. 세균과 세포의 수
- 세균과 세포의 수는 20~40개의 현미경 시야 (field)를 확인하여 결정합니다.
5. 세포의 수
- 저배율에서 시야당 세포 개수를 계산하여 다음과 같이 보고합니다.
- 1+ (rare): 1개 미만
- 2+ (few): 1~9개
- 3+ (moderate): 10~25개
- 4+ (many, heavy): 25개 초과
- 세포의 종류 (상피세포, 백혈구, 적혈구 등)를 기록합니다.
6. 세균이나 진균의 수, 형태
- 유침렌즈 (1000배에서 immersion oil 사용)에서 관찰하여 시야당 몇 개가 관찰되는지 셉니다.
- 1+ (rare): 1개 미만
- 2+ (few): 1~5개
- 3+ (moderate): 6~30개
- 4+ (many, heavy): 30개 초과
- 형태: 알균 (pairs, chains, clusters), 막대균 (large, small, branching, coryneform, filamentous, pleomorphic) 등으로 세균의 형태를 묘사합니다. 효모나 균사가 관찰되면 그것을 기록합니다.
7. 세균이 너무 드물게 관찰되는 경우, 염증소견이 없고 슬라이드에 세균이 고르게 분포되어 있지 않은 경우에는 시험관, 슬라이드, 배지 등의 비생존균때문일 수 있습니다. 해석 시 주의하며 재염색하여 확인합니다.
8. 결과 해석
- 정상적으로 무균상태여야 하는 부위에서 채취한 검체에서 세균이 관찰되면 그 세균에 의한 감염임을 의미합니다.
- 비침습적 검체에서 백혈구와 함께 한 종류의 세균이 대량으로 관찰되면 감염을 의미합니다.
정도관리
매일 염색 시약을 확인합니다.
시약에 침전물이 있으면 사용하기 전에 여과합니다.
오염이 의심되면 새로운 lot number의 시약으로 교체합니다.
새로운 lot No.의 시약을 사용하기 전에는 그람 양성 및 음성 정도관리균으로 염색하여 확인합니다.
시간이 경과하여 시약이 증발하면 효과가 변할 수 있으므로 시약을 다 사용하지 않았더라도 주기적으로 교환해야 합니다.
그람 염색이 잘 되지 않아서 결과 해석이 부정확하거나 판독하기 어려운 경우에는 슬라이드가 깨끗한지, 검체 도말이 너무 두껍지 않은지, 열고정을 할 때 열을 과하게 가했는지, 잘 고정되지 않은 검체르 ㄹ과도하게 씻어낸 것은 아닌지, 시약에 침전물이 있는지 등을 확인합니다.
그람 염색의 결과를 추후 배양 결과와 비교해서 그람 염색 결과가 타당했는지 확인하여 해석의 정확성을 높입니다.
Reference
Laboratory medicine, 5th ed.
