유세포 분석 3 (non-viable cells)

Flow cytometry of lymphnode and other 'solid' tissues-exclusion of non-viable cells에 대해 알아보려고 합니다.
유세포 분석에서 림프절과 다른 '고형'기관의 gating 방법입니다. 살아 있지 않은 세포들은 제외하고 7-AAD 음성 부분으로 gating합니다 (PI를 이용한 결과와 유사합니다.).  High grade lymphoma는 증가된 살아있지 않은 세포나 종양 세포의 완전한 탈락으로 인해 양성 림프구만이 남아있는 경우가 종종 있습니다.  살아 있지 않은 세포는 항체의 비특이적인 흡수를 일으켜 결론에 이르지 못하거나 해석할 수 없는 결과를 나타낼 수 있으므로 유세포 분석에서 제거 되어야 합니다.  살아 있지 않은 세포의 수가 증가한 유세포 분석 결과는 주의 깊게 해석해야 하고 최종 진단은 일상적으로 고정 과정을 거친 조직의 형태학적 평가가 바탕이 되어야 합니다. Low-grade(small cell) lymphoma는 유세포 분석이 늦어지더라도 살아있는 세포가 남아있어 분석이 가능합니다. 

Intensity of staining and co-expression of antigens에 대해 알아보겠습니다.
염색 결과는 음성 control과 각각의 항체의 강도를 비교하여 나타내 집니다.  음성 control과 형광 강도가 비슷한 경우 음성으로 정의할 수 있습니다.  어떤 표지자 (항체) 의 expression (형광강도) 이 음성 (isotypic) control 보다 큰 경우 양성이라고 합니다. 불균질한 검체 (e.g. 골수) 일 경우 고유의(built-in) 음성 control 사용은 결과의 잘못된 해석을 유발할 수 있으므로 제한됩니다. 다른 세포집단은 종종 여러 가지 'background' (비특이적) 염색의 강도를 나타냅니다. 어떤 세포 (e.g. monocytic cells, atypical promyelocytes and large lymphomatous cells with decreased viability)는 종종 높은 비특이 염색을 나타냅니다. 그러므로 양성과 음성 표현의 역치는 특정한 표지자에 대해 음성임을 알고 있는 세포 집단과 비교가 아니라 control(음성) 검체를 바탕으로 하여 각각의 세포 집단마다 세워져야 합니다. 만약 CD14 염색만 시행하였다면, CD14를 express 하지 않는 림프구에서 보다 더 높은 강도를 나타내는 각각의 파편은 (red dot) 양성으로 생각할 수 있습니다.  하지만 음성 (isotypic) control 항체와의 염색처럼 비정상 세포(green and blue dots)는 아주 높은 비특이 염색을 보이고, CD14와 유사합니다.
일반적으로, 양성은 dim, moderate, bright 그리고 variable로 분류할 수 있습니다. red dots는 CD3 음성인 림프구를 나타낸다.  Dim 염색은 음성control과 비교하여 형광 강도가 약간 증가한 경우를 말합니다. CD3의  dim to moderate expression을 나타냅니다.  Moderate 염색은 적어도 음성 control 보다one log decade 강도가 센 것을 나타냅니다. 두가지 세포의 세포 집단을 보여줍니다. 하나는CD2의 dim 그리고 다른 하나는 moderate한 expression입니다.  림프구의 비정상 세포 집단 (dim CD2) 은 정상 림프구와 비교해서 크기가 큰 세포로 FSC증가를 보입니다. Bright 염색은 음성 control 보다 적어도 two log decade 더 강도가 센 경우를 말합니다. T-prolymphocytic leukemia(T-PLL) 세포 그리고 B lymphoblasts 는 각각 CD5, CD10의 bright expression을 나타냅니다.
혈액 종양의 진단 및 분류는 표지자나 형광 강도의 양성과 음성 표현의 구분 뿐 아니라 세포의 같은 세포 집단에서 두 가지나 그 이상 표지자의 co-expression을 확인하는 것도 중요합니다.  예를 들어, B-CLL/SLL 그리고 hairy cell leukemia (HCL) 은 각각 CD5/CD23 그리고 CD25/CD103의 coexpression이 특징입니다.  한 세포에서 여러 항원의 co-expression 분석 가능성은 multicolor 유세포 분석의 가장 큰 장점입니다.  이제 4-color 를 대신해서 6-color가 시작되었습니다.  그것은 다른 5개의 표면 표지자 (각각의 튜브에서 축(고정) 역할을 하는 CD45나 7-AAD를 제외한) 분석을 가능하게 합니다. 혈액 종양에서 여러 가지 항원의 co-expression을 보여줍니다.