유세포 분석 (flow cytometry)

유세포 분석 (flow cytometry)에 대해 알아보겠습니다. 유세포 분석은 혈액 종양 진단에 중요한  역할을 합니다.  유세포 분석은 예후와 치료 후 모니터링에 관한 자료를 제공함으로써 종양의 관리에 중요한 방법 중 하나입니다.  유세포 분석에는 신선한 (고정되지 않은) 물질이 필요합니다.  적절한 검체로는 혈액, 골수 천자 (그리고 신선한 core biopsy), 신선한 조직 검체 (excisional or core biopsies), 미세침 천자와 체액 등이 있습니다. 유세포 분석은 양성과 종양 단계 사이의 구분을 가능하게 합니다. 하나의 표지자로 정확한 계통을 정하는 것은 어렵지만 항체 패널을 이용하여 분석하면 각각의 다른 예후와 치료를 필요로 하는 여러 가지 아형의 혈액 종양을 분류할 수 있습니다. 유세포 분석은  B세포와 T세포 종양의 구분, 성숙 미성숙 종양을 정확히 구분하고 골수 (myeloid) 계열인지 림프 (lymphoid) 계열인지 결정합니다.  멀티 파라미터 (4-6 color) 분석은 하나의 세포에 대한 여러 가지 마커들의 치료 후 연속적인 평가를 가능하게 하여 정확한 성분과 개체수를 분석할 수 있게 합니다.  유세포 분석은 DNA 배수성, 증식 (S기), 그리고 세포 사멸 (apoptosis) 분석에 사용될 수 있습니다.  ZAP70 그리고/또는 CD38 반응성은 B 만성림프구성 백혈병 (B-CLL) 환자에서 예후 표지자로 유용합니다.  IgVh 재배열이 없는 CLL은 CD38 그리고/또는 ZAP70에서 더 자줒 양성을 보이는데 이 경우 이러한 마커들에 주로 음성을 보이는 IgVh 재배열 CLL보다 예후가 나쁜 것과 연관되어 있습니다.
  또한 여러 가지 혈액학적 장애에서 유세포 분석을 통하여 특정한 표현형의 감별하는 것은 질병 모니터링의 훌륭한 방법입니다.
  항원 반응성의 비정상적 패턴 인지는 다음 화학치료법이나 골수 이식 후 환자의 모니터링, 그리고 잔여질병 (residual disease)에서 재생된 골수의 구분을 도와줍니다.  Minimal residual disease(MRD : 미세잔존암) 평가에서 유세포 분석의 민감도는 분자 실험 (polymerase chain reaction(PCR))의 민감도와 유사합니다.  치료 중이거나 치료 후의 환자에서 악성세포 각각의 감별은 환자의 치료에 대한 반응성과 예후를 표지하는 강력한 매개변수입니다. 유세포 분석은 임상의가 치료를 모니터링하고 수정할 수 있게 합니다. 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 에서, 첫 치료에 대한 처음 반응의 평가에 기초를 둔 MRD는 매우 적절한 진단 방법로 나타났습니다.  특히 어린이 ALL에서 MRD는 단독적인 예후인자를 나타내고, 정확한 위험 그룹 분류를 가능하게 합니다.  환자의 대부분이 전통적인 치료 다음에 양성인 MRD 가 남아있기 때문에 CLL이나 비호치킨 림프종 (NHL) 환자에서 MRD 예후의 중요성은 아직 논쟁에 있습니다.  Alemtuzumab (Campath) 나 자가 줄기세포 이식을 통해 치료 후 CLL 완전관해 (complete remission) 환자에서 MRD의 존재는 MRD negative 완전소실 환자에 비해 더 짧은 생존률을 보입니다.
  치료 마지막 MRD상태는 보통의 반응 기준보다 소실의 지속이 더욱 예견되고 조기 질병 진행성의 위험이 있는 환자를 확인합니다. 
  유세포 분석에 의한 림프종의 단계는 대부분 골수에서 조직 형태학적 (histomorphologic) 양상과 일치하지만 환자의 14~21%는 일치하지 않기 때문에, 유세포 분석은 골수 생검의 조직학적 평가와 동반 되어야 합니다.  Low grade B -cell lymphoma의 혈액 침범양성은 대부분 골수 침범과 관련있습니다.
  유세포 분석 프로토콜은 검체와 항체를 반응시키고, 다음에 적혈구를 용해시키고, 세척, 파라포름알데히드로 고정, 그리고 분석을 합니다.  전혈 용해는 검체 준비 중 가장 흔히 쓰이는 방법입니다. 일상적으로 5000에서 10000 개의 세포가 모아집니다.  유세포 분석에 사용되는 단클론 항체는 유세포 분석기의 레이저에 의해 흥분 (excitation) 되거나 자극되는 형광물질과 결합되어 있습니다. 가장 흔히 사용되는 형광물질은  488nm (아르곤 레이저) 에서 흥분상태가 되며 fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), propidium iodide (PI), 7-amino-actinomcyinD (7-AAD), peridin-chloryophyl-A-protein (Per-CP) 그리고 dimmers of thiazole orange (TOT-1) 등이 있습니다. 데이터는 하나의 매개변수나 두 개의 매개변수로 나타내어진 히스토그램 상에 보여집니다. 유세포 분석기에 의해 감지된 대부분의 항원은 세포의 표면에 존재합니다.  세포 내의 성분을 염색하기 위해서는 permeabilization과정 (항체가 세포막의 구멍을 통해 세포 속으로 들어갈 수 있도록)이 필요합니다. 임상적 진단을 위해 혈액학적 종양을 평가하기 위해서는 최적의 시약 수가 필요하고  적절한 실험실 데이터와 감별 진단은 세포 형태학에 기초 됩니다. 유세포 분석은 면역 조직학 검사보다 빠르고 초당 1000개의 세포가 분석 가능합니다.  또 다른 장점은 하나의 세포에 상응하는 여러 가지 표지자가 가능하고 염색된 강도와 항원의 비정상적 표현을 감지할 수 있습니다.  유세포 분석은 B세포 림프증식성 질병 (B cell lymphoproliferative disordor) 과 백혈병에 높은 감도를 가지고 있고, 이런 신생물의 여러 종류들에 높은 특이성을 갖습니다.  이 모든 것들이 신생물을 하위분류하여 혈액학적 진단을 하는데 사용됩니다. 유세포 분석의 가장 큰 단점은 액상의 세포 부유액이 필요한데 그로 인해 조직형태학적 모양 (조직 구조) 과 상관관계가 부족하다는 점입니다.  유세포 분석은 살아있는 신선한(고정되지 않은) 물질이 필요합니다.  특히 high-grade lymphoma에서 신생물의 생존률 저하는 유세포 분석을 불가능하게 합니다.  유세포 분석은 튜브당 적어도 10000~20000개의 세포가 필요한데, 뇌척수액 (CSF), 미세침 천자와 paucicellular (세포수가 적거나 또는 섬유성) 병변등에서는 종종 제한됩니다.  낮은 생존률이나 조직 성분의 부분적 치우침 때문에 탈락된 종양세포는 위음성을 나타낼 수 있습니다.