지난 글에서는 유세포분석의 일반적인 원리에 대해서 주로 다루었고 임상적인 활용 방법으로 림프구아형검사 (lymphocyte subset)를 간단하게 언급했습니다.
이번 글에서는 유세포분석의 원리를 다시 한 번 설명할 것입니다.
* 유세포분석의 원리 (Principles of flow cytometry)
세포부유액을 형광염색한 후 세포를 하나씩 흐르게 하면서 레이저 광선 (laser beam)을 가하면, 광원에서 온 빛이 세포에 의해 산란됩니다.
산란된 빛을 빛의 방향과 같은 방향인 전방 산란 (forward scatter, FSC)과, 다른 방향인 측방 산란 (side scatter, SSC)에서 각각 측정하고, 형광염색에 의해 각 세포가 발하는 형광을 측정합니다.
유세포분석 검사는 이렇게 측정된 광학적 신호를 컴퓨터로 분석하는 세포 측정 방법입니다.
전방 산란 (forward scatter, FSC)은 세포의 크기를 반영하는 지표입니다.
측방 산란 (side scatter, SSC)은 세포내 과립 등 세포내 복잡성을 반영하는 지표입니다.
유세포분석 장비 (flow cytometer, 유세포분석기)에는 여러가지가 있습니다.
Becton-Dikinson (BD)제조사의 FACS Calibur, FACSCanto II 등이 있습니다.
Beckman-Coulter 제조사의 Navios, FC500 등이 있습니다.
유세포분리기 (cell sorter)는 세포부유액에서 분리하고자 하는 세포에 전기적 부하 (electric charge)를 준 후, 각 세포를 세포방울 (droplet)로 만들어서 세포방울을 전기적 부하가 걸린 두 판 (electrically charged deflection plate) 사이로 통과시켜 개별 세포의 전기적 부하에 따라 세포들을 물리적으로 분리시키는 장비입니다.
유세포분리기는 유세포분석기와 결합되어 있습니다.
유세포분석의 특성 및 장점은 다음과 같습니다.
1) 초당 수천 개의 세포를 분석하며 극히 적은 양의 형광물질까지 측정할 수 있습니다.
2) 여러 종류의 세포가 혼재하는 세포부유액에서 측정하고자 하는 세포군을 정의하여 특정 세포군의 성상을 측정할 수 있습니다.
3) 다색 (multicolor) 분석이 가능하여 특정 세포의 여러 특징을 개별적 또는 통합적으로 측정할 수 있습니다.
유세포분석의 단점 및 제한점은 다음과 같습니다.
1) 세포부유액으로 측정하므로 세포의 인체 내 해당 조직에서의 구조적 특성을 알 수는 없습니다.
2) 살아있는 세포로만 분석이 가능합니다.
* 세포부유액의 준비 및 보관
정확한 검사 결과를 위해서는 측정하고자 하는 세포가 한 개씩 분리되어 있고 살아있어야 합니다.
세포생존도 (viability)는 크게 2가지 방법으로 측정할 수 있습니다.
7-amino-actinomycin D (7-AAD): 살아있는 세포를 염색하지 않아 염색에서 배제시키는 형광염료입니다.
Propidium iodide: 죽은 세포를 염색하는 형광염료입니다.
세포생존도 (viability)가 80% 미만인 경우에는 결과가 위음성으로 나타날 수 있습니다.
측정하고자 하는 세포가 한 개씩 분리되어 있어야 한다고 했습니다.
말초혈액 (PB), 골수 흡인액 (BM aspirate), 각종 체액 (뇌척수액 (CSF), 기관지폐포세척액 (BAL), 복막액 (ascites), 흉강액 (pleural fluid) 등)은 이미 개별 세포로 되어 있으므로 그대로 형광염색합니다.
고형 조직은 물리적 또는 효소처리하여 개별세포로 분리하여 형광염색합니다.
EDTA tube에 채취한 검체는 24시간 이내에, heparin tube에 채취한 검체는 48~72시간 이내에 검사해야 합니다.
검체 보관은, 예전에는 면역글로불린 (항체)이 세포 표면에 부착하거나 특정 항원이 세포질내로 숨는 것을 방지하기 위해 18~22도씨 실온에 보관하는 것이 원칙이었습니다.
최근에는 냉장 보관해뒀다가 검사 30분 전에 꺼내서 실온에 둔 후 검사하도록 권장합니다.
* 형광 염색
1) 형광의 종류 및 특성
유세포분석에서 광원으로 argon 등의 레이저를 사용합니다.
세포의 특성 (어떤 항원을 발현하는가)을 알아보기 위한 단클론항체 (monoclonal antibody)를 표지하는 형광 및 DNA, RNA 염색에 사용하는 형광의 종류는 다양합니다.
두 형광을 병합하여 만든 형광 (tandem dye)도 사용할 수 있습니다.
측정 민감도는 사용하는 단클론항체의 특이도, 친화력 (affinity), 표지 형광의 특성에 달려있습니다.
2) 세포표면항원 (cell surface antigen) 염색
- 직접면역형광염색 (direct immunofluorescence stain)
형광표지된 단클론항체와 세포부유액을 혼합하여 보온 후 유세포분석을 합니다.
백혈구에 대하여 검사하고자 하는데 골수 흡인액, 혈액 등 적혈구가 혼재되어 있는 검체는 NH4Cl 용액 (lysing solution) 등으로 적혈구를 용해한 후 세척한 다음 분석합니다.
유세포분석을 즉시 시행하기 어려운 경우에는, 1% 포르말린 또는 파라포름알데하이드 용액으로 고정하여 4도씨 냉암소에 보관했다가 24시간 이내에 검사합니다.
세포표면 또는 세포질내 면역글로불린을 측정하고자 하는 경우, 37도씨로 보온한 PBS (phosphate buffered saline. 완충액)로 2~3회 세척하여 단순히 혈장 내에 있던 면역글로불린 및 세포에 비특이적으로 결합한 면역글로불린을 제거한 후 형광표지된 항체와 보온합니다.
- 간접면역형광염색 (indirect immunofluorescence stain)
형광표지되지 않은 일차항체를 세포의 해당 항원 부위에 결합시킨 후, 형광표지된 이차항체 (일차항체에 대한 항체)를 가하여 항원을 측정하는 것입니다.
형광표지된 일차항체를 구할 수 없는 경우 사용하는 방법입니다.
3) 세포내 항원 염색
세포내 항원에는 세포질내 항원 (cytoplasmic antigen)과 핵내 항원 (nuclear antigen)이 있습니다.
세포질내 항원의 대표적인 예로는 cytCD3, cytCD22, cytCD79a, myeloperoxidase (MPO) 등이 있습니다.
핵내 항원의 대표적인 예로는 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), cyclin D1 등이 있습니다.
세포내 항원을 측정하기 위해서는 형광표지된 항체가 세포막을 통과해야 합니다.
측정하고자 하는 세포를 투과성 용액 (permeabilizing solution)으로 처리한 후 면역형광염색을 하면 됩니다.
4) 세포 기능 검사
- 세포의 탐식 (phagocytic) 기능 (형광표지된 bead, 세균, Candida 등을 표적세포로 사용)
- 세포 내에 생성된 활성산소에 의한 형광성 변화 (dihydrorhodamine, 2,7-dihydrochlorofluorescein diacetate 등)에 의한 호중구의 호흡터짐 (respiratory burst) 활성도 측정
- NK cell 활성도 측정
* 분석 세포의 선택
세포군을 gating하는 기준/지표에는 빛의 산란 정도와, 표지된 항체와 결합하여 발생하는 형광신호가 있습니다.
- Forward scatter cytogram (FSC): 세포의 크기를 반영
- Side scatter cytogram (SSC): 세포내 복잡성을 반영
이러한 기준에 따라 여러 세포군 (region)을 gating (게이팅)한 후 각 세포군 (gate)의 특성을 분석할 수 있습니다.
세포부유액의 구성이 비교적 단순한 경우에는 FSC, SSC로 분석하고자 하는 세포를 게이팅합니다.
세포의 특성을 반영하는 형광 신호를 이용하여 gating할 수도 있습니다.
혈액질환 분석에는 common leukocyte antigen인 CD45와 SSC로 gating하여 특정한 종류의 백혈구만을 분석하는 방법이 널리 사용됩니다.
(아세포 (모구, blast), 호중구 (neutrophil), 림프구 (lymphocyte), 단핵구 (단구, monocyte) 등 백혈구의 세부 종류마다 CD45의 발현 정도, SCC가 다릅니다.)
이를 대략적으로 나타내면 다음과 같습니다.
* 유세포분석 결과 해석, 판독, 보고
세포가 특정 항원을 발현하지 않더라도 비특이적으로 조금은 반응이 관찰될 수 있습니다.
형광표지된 항체를 사용하여 염색하는 경우, 이러한 비특이 반응의 정도를 파악하여 양성의 기준을 정해야 합니다.
동형 대조 (isotypic control)란, 같은 종류의 형광이 표지되고 항원 특이성이 없는 동종의 면역글로불린과 검체를 반응시킨 대조군입니다.
이러한 isotype control을 함께 검사하여, 동형 대조에서는 양성의 비율이 2% 미만이도록 cutoff 를 설정하여 분석합니다.
유세포분석 결과 보고에는 다음과 같은 항목이 포함되어야 합니다.
백혈병 (leukemia) 면역표현형 (immunophenotype) 분석을 예로 들면, 우선 검체 내에서 비정상세포의 비율을 보고합니다.
(전체 중 Gating한 부분의 비율)
급성 백혈병의 표지자 중 골수세포형과산화효소 (myeloperoxidase, MPO)와 TdT는, gating한 세포군 내에서 이들을 발현하는 백분율이 10%이상이면 양성으로 해석합니다.
세포질 항원 CD3, CD79a, CD22, CD13과 세포표면항원 CD41, CD61, CD34 등은 검사실에 따라 10% 또는 20%보다 클 때 양성으로 해석합니다.
그 외 항원은 20%이상이면 양성으로 해석합니다.
(만성림프구백혈병 (chronic lymphocytic leukemia, CLL)에서는 30%)
비정상세포가 발현하는 특정 항원의 분포 및 강도가 진단 및 질환의 분류에 중요합니다.
분포는 음성/양성/부분 발현 (negative/positive/partially expressed)으로 보고합니다.
강도 (intensity)는 동형 대조의 형광 강도와 비교하여 그 차이가 '한 log'보다 작으면 약양성 (dim), 한 log 이상 ~ 두 log까지 차이가 나면 중등도 양성 (intermediate/moderate), 두 log보다 크면 강양성 (bright), 다양하게 나타나면 이형 양성 (heterogeneous)으로 보고합니다.
Reference
Hematology, 3rd ed.
[관련 글]
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