이번 글부터 3개의 글에 걸쳐서 유세포분석 (flow cytometry)에 대하여 다룰 것입니다.
유세포분석 (flow cytometry, FCM)은 Laser를 이용하여 개별 세포 수준에서 형광을 분석하는 방법 중 하나입니다.
단일 세포 부유액 (single cell suspension)을 고정된 laser beam 속으로 흘려서 지나가는 세포를 측정합니다.
* 유세포분석을 통해 무엇을 측정하는가? (측정 대상)
세포 (세포 표면이나 세포내 항원, 핵 성분), 바이러스 입자, DNA 분절, 세균, latex beads
부유액의 흐름 속에서 이동하는 측정 대상 물체를 입자 (particle)라고 합니다.
유세포분석 장비가 인식한 한 개의 입자 결과를 이벤트 (event)라고 합니다.
측정 항목 (parameter)은 산란광 (light scatter), 형광 (fluorescence)입니다.
* 산란광 (light scatter)
Forward scatter (FSC): 입자나 세포의 크기 (size)에 비례합니다.
Side scatter (SSC): 세포내 과립 (granule)의 수나 핵의 접혀진 정도에 비례합니다.
* 유세포분석 장비의 구성
유세포분석 장비는 원리적으로 fluidics, optics, electronics로 구성되어 있다고 볼 수 있습니다.
Fluidics에 의해 입자가 flow chamber로 주입되어 일렬로 laser beam과 교차하여 신호 (signal)을 발생시킵니다 (optics).
이 신호를 전자적으로 계측한 데이터를 모니터에 나타내고 저장합니다 (electronics).
* 유세포분석 장비를 보정 (calibration)하는 방법에는 수행능 최적화 (performance optimization)와 보상 (compensation)이 있습니다.
1) 수행능 최적화 (performance optimization)
각각의 parameter의 검출 강도를 조정하기 위한 방법은 다음과 같습니다.
Forward scatter (FSC)는 증폭기 ("Amp")에 적용되는 gain을 조정합니다.
Side scatter (SSC), 형광 (FL1 등)은 photomultiplier tube (PMT)에 적용되는 voltage (전압)를 조정합니다.
보통의 경우, 전용 bead와 소프트웨어로 하루에 1회 보정 (calibration)합니다.
사용되는 bead에는 중등도 밝기의 형광 bead와 무형광 bead가 있습니다.
무형광 bead로 forward scatter (FSC)의 강도 범위가 정해지고, 각각의 PMT에 적용할 전압이 결정됩니다.
형광 bead 혼합물로 형광간 보상 (compensation) 수치가 결정됩니다.
유세포분석 장비 (유세포분석기) 사용자가 직접 최적화 (optimization) 설정을 하기 위해서는 염색 및 비염색 림프구 (stained and unstained lymphocytes)를 이용합니다.
Forward scatter (FSC)는 림프구 군집의 중심이 FSC 축의 중간 바로 이전에 위치하도록 설정합니다.
Side scatter (SSC)와 형광 (FL1 등)은 비염색 림프구의 90% 이상의 신호가 히스토그램상 10의 1승 이하 영역에 나타나도록 설정합니다.
- 유세포분석 장비 수행능 평가 (performance evaluation) 방법
보정 (calibration) 결과를 통해 유세포분석 장비의 수행능을 평가할 수 있습니다.
신호 분리 정도 (separation)가 충분한지 평가하기위해, 각각의 형광 매개변수의 히스토그램에서 무형광과 형광 bead peak간의 차이를 확인합니다.
산란광 (light scatter)은 장비의 자체 noise와 bead의 peak 분리 정도를 비교합니다.
개별 peak의 변동계수 (변이계수. coefficient of variation, CV)가 허용한계 이하인지 확인합니다.
- 동기화 (synchronization)
Argon laser, red diode laser 등 2종류의 레이저가 capillary (모세관) 내 흐름에서 서로 다른 지점을 쏘는 경우, 한 입자가 첫번째 laser beam을 만난 후 다음 laser beam과 만나기까지 지연시간 (delay time)이 발생합니다.
동기화 (synchronization)은 이 지연시간을 고려하여, 발생한 신호들을 한 입자에서 유래한 것으로 맞추는 과정입니다.
Laser delay time (지연시간)은 입자 이동 시간 (transit time)에 큰 영향을 받으므로 안정적인 fluidics와 정기적인 time-delay calibration이 필요합니다.
2) 보상 (compensation)
대부분의 형광 색소의 방출 범위 (emission spectra)는 일부 겹칩니다.
따라서 한 측정기에서 특정한 한 가지 형광만의 방출 강도 (intensity)를 결정하려면 검출된 총 형광 강도에서 다른 형광색소가 겹쳐서 증가시킨 강도를 빼야 합니다.
이 과정을 보상 (compensation)이라고 합니다.
보상 과정은 데이터 수집 (acquisition) 시 장비가 신호를 처리하는 과정에서 이루어지거나, 나중에 자료를 분석하는 단계에서 소프트웨어적으로 이루어집니다.
장비 세팅에 필요한 보상계수 (coefficient)는 보정 (calibration) 과정에서 소프트웨어에 의해 자동으로 정해지는데, 사용자가 상황에 맞게 설정할 수도 있습니다.
* 데이터 수집 단계 (data acquisition)
1) Trigger, detection threshold
Detection threshold (검출 역치)는 plot gate와는 다른 일종의 acquisition gate로, 입자가 capillary를 지나갈 때 발생한 시호를 장비가 event로 인식할지 결정하는데에 cutoff가 되는 trigger parameter 값입니다.
잡음 신호를 제거하기 위해 주로 forward scatter (FSC)가 사용됩니다.
전체 군집의 0.1%미만의 드문 event의 세포 신호를 수집하려면 해당 형광 신호를 trigger로 이용하는 것이 효과적입니다.
2) 수집 방식
증폭기에서 신호를 증폭할 때 두 가지 방식이 있습니다.
Linear mode는 그대로 처리되는 것입니다.
Logarithmic mode는 로그형 증폭기를 거치는 것입니다.
Logarithmic mode는 신호 강도가 낮은 영역이 확대되고 높은 영역이 압축되어 나타나므로 형광 신호에 사용됩니다.
광산란 (light scatter)은 대상이 백혈구인 경우 linear mode, 혈소판인 경우 logarithmic mode를 사용하는 것이 일반적입니다.
3) 수집 속도, 시간
적당한 샘플 주입 속도는 장비의 신호 처리 능력과 샘플의 입자 농도에 달려있습니다.
장비가 한 입자의 신호를 처리하는 동안 system dead time이 발생하며, 이 때 뒤따르는 다른 입자의 신호는 누락됩니다.
장비의 electronics가 처리할 수 있는 한계 이상으로 주입 속도를 높이면, laser beam을 지난 일부 입자의 데이터가 유실됩니다.
샘플 내 입자 농도가 너무 높으면 laser beam 속을 지나면서 밀착된 다수의 입자가 하나의 event로만 인식될 수 있습니다.
이러한 현상은 드문 event를 검출할 때 특히 문제가 되는데, doublet discrimination이라는 소프트웨어적인 기법으로 일부 보정할 수 있습니다.
Doublet discrimination은 event의 pulse signal의 모양 (너비, 높이, 면적)을 분석하여 입자가 doublet인지 아닌지 판별하는 것입니다.
부유액의 세포 농도는 대개 
최근의 장비는 수집 처리 속도 20000 events/sec까지 가능합니다.
사용자가 검사 목적에 맞게 유속 (flow rate)을 조정하는데, 대개의 경우 초당 1000 event정도로 설정하면 적당합니다.
DNA index 등 높은 민감도와 낮은 변이계수를 요구하는 검사에서는 100~300 events/sec의 유속을 유지해야 합니다.
측정치의 신뢰도를 높이기 위해서는 충분한 수의 이벤트를 수집해야 합니다.
분석할 세포의 수는 대개 2000~20000개 정도가 적절합니다.
혹은 히스토그램에서 gating한 관심 세포의 peak가 대개 5000 events 이상으로 이루어진 것이 좋습니다.
만약 분석하고자 하는 관심 세포의 구성 비율이 전체 세포의 50%라면 총 10000 events 이상을 수집해야 한다는 뜻입니다.
말초혈액 CD34+ (양성) stem cell (줄기세포) counting 등 드문 세포 (이벤트)를 검출하기 위해서는 50000 events 이상 수집해야 합니다.
시중에서 사용되는 유세포분석 장비의 검체간 carryover는 0.1~1.0% 정도입니다.
드문 세포를 검출하는 검사의 경우 이전 시험관으로부터의 carryover에 더욱 민감합니다.
이를 해소하기 위해 샘플 시험관 교체 중간에 증류수가 담긴 시험관을 장착하고, background가 안정될 때까지 가동해야 합니다.
* 데이터 분석 단계 (data analysis)
1) Gating
데이터 수집 (data acquisition) 후 데이터 분석 단계에서는, plot gate를 이용하여 특정 세포 아군 (subset)을 분석할 수 있습니다.
그러기 위해 수집한 전체 세포의 저장된 자료 중에 분석하고자 하는 subset의 자료를 추려내는 것을 gating이라고 합니다.
Gating은 애초부터 세포를 물리적으로 분리하는 sorting과는 다른 개념입니다.
Forward scatter (FSC) / side scatter (SSC) plot에서 광산란 gate를 이용하는 것이 기본적입니다.
CD45/SSC gate도 자주 사용되며, 다색 형광으로 정의하는 anchor gate도 있고, CD34 stem cell counting에서는 sequential (Boolead) gating 기법을 이용하기도 합니다.
2) 판정
측정된 형광 강도 (intensity)는 함께 측정한 음성 대조 (negative control)와 비교하여 판정합니다.
음성 대조로는 외부 대조 (external control)로서 별도의 시험관을 마련하거나, 내부 대조 (internal control)로서 샘플 시험관 내 음성 세포를 이용할 수 있습니다.
샘플의 평균 형광강도 (mean fluorescent intensity, MFI)를 비교적 객관적으로 표현하려면, 음성 대조와 비교하여 sample/control MFI ratio를 구합니다.
양성 세포의 백분율을 구하려면, isotype control immunoglobulin을 이용한 히스토그램에서 양성 백분율이 1% 미만이 되도록 cursor setting을 한 후, 이를 검사 히스토그램에 옮기면 우측 영역이 양석 백분율이 됩니다.
양성 세포의 백분율을 구하는 다른 방법으로 channel-by-channel subtraction method가 있는데, 이는 control과 샘플 히스토그램을 중첩시킨 후 샘플이 대조와 겹치지 않는 우측 영역을 양성 백분율로 판정합니다.
* Multiparameter analysis (다중 파라미터 분석)
Multicolor (다색상) 유세포분석에서 fluorochrome 조합의 예는 대개 정해져 있습니다.
FL1, 2, 3, 4의 4색: FITC, PE, PE-Cy5 (또는 PerCP), APC
FL1, 2,3, 4, 5의 5색: FITC, PE, PE-TR, PE-Cy5 (또는 APC), PE-Cy7
APC와 PE-Cy5는 두 레이저 간 지연시간을 적용할 수 있는 장비로만 구분할 수 있습니다.
* 유세포분석법의 임상 응용
유세포분석은 lymphocyte subset (림프구아형 검사), 조혈모세포 수 측정, 면역표현형검사 (백혈병, 림프종 등), 혈소판 항체검사, 호중구 항체검사, HLA crossmatching (교차시험), 호중구 기능 평가 (dihydrorhodamine-123을 H2O2에 대한 탐색자로 이용) 등에 사용됩니다.
* 림프구아형 검사 (lymphocyte subset)
림프구아형검사의 술식은 직접면역형광법입니다.
T-cell subset을 평가하기 위한 4색 염색법에서는 CD3-FITC, CD8-PE, CD45-PerCP, CD4-APC로 구성된 단클론항체 (monoclonal antibody)의 조합을 사용합니다.
이 시약으로 전혈을 염색한 후, 측정에 방해되는 적혈구는 NH4Cl이 포함된 저장성 용액을 lysing solution으로 사용하여 용혈시킵니다.
남아 있는 백혈구에 대하여 데이터를 수집하면 FSC, SSC, FL1, FL2, FL3, FL4 총 6개의 parameter에 대한 각 세포의 측정치가 얻어집니다.
이 자료에 gating을 활용하여 관심사인 T-cell subset의 백분율을 얻는 것입니다.
AIDS 환자 등에서 CD4+ T-cells의 절대수 (T-cell count)를 구해야 하는 경우가 있는데, 그 방법은 2가지가 있습니다.
Two stage 법: CBC 결과를 참조하여 WBC count (/μL) × % lymphocytes × % T-cells × % CD4+ T-cells로 계산하는 방법입니다.
One stage 법: 염색 전에 미리 전혈에 첨가하여 함꼐 측정된 형광 couunting beads의 개수로 계산하는 방법입니다.
Reference
Laboratory medicine, 5th ed.
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