HLA crossmatch (교차시험)

환자 혈청에 공여자의 HLA 항원에 반응하는 HLA 항체가 존재하는지 검사하는 것.

환자 혈청, 공여자의 림프구를 이용.

CDC (NIH법, AHG법), flow cytometry 이용.

* Lymphocyte 분리

1. MNC 분리 (by Ficoll-Hypaque, centrifugation)

RBC - Granulocyte - 비중액 - MNC - Plasma

2. MNC 중 lymphocyte 분리 방법

   1) Thrombin 가하고 mixing 하면 granulocyte는 thrombus 형성하면서 가라앉음 (by 3초 centrifugation)

   2) Lymphocyte % 적을 것으로 예상되는 경우 (뇌사자 등)

      Monoclonal Ab 부착된 bead를 이용하여 lymphocyte 외 다른 cell을 흡착, magnetic field로 분리해내고 남은 lymphocyte를 활용.

      EasySep (STEMCELL)

* Neubauer chamber, 현미경 관찰하여 lymphocyte가 2~3 X 10^6/mL가 되도록 함.

* Complement (rabbit) 가하면, 항원-항체 반응이 있는 경우 complement dependent toxicity에 의해 cell에 구멍이 나고, 구멍으로 Eosin Y 염색약이 들어가 검게 염색되는 것을 위상차현미경으로 확인할 수 있다. 1:32까지 검사.

* Negative control (by AB형 plasma 등), auto control 등 필요

* NH4Cl 처리: RBC lysis. RBC는 Eosin Y 염색의 false negative의 원인.

* Pronase 처리: B cell에서 비특이적인 형광을 초래하는 세포 표면 Fc receptor를 제거하여 특이도를 향상시킴.

  Rituximab (anti-CD20) 사용한 환자는 위양성이 나타날 수 있어 이를 감소시키기 위해 pronase를 더 많은 용량 처리해볼 수 있다.

* 자가대조 양성 (또는 NIH 법에서 양성이면서 AHG 법에서 음성인 등 IgM 의심되는 경우)

  DTT처리 등으로 IgM 불활성화

* Flow crossmatch는 CD3, CD19로 T cell, B cell 구분하고 FITC 축의 MCS (median channel shift) 등으로 판정. (linearity or log scale)