HLA 검사 (HLA typing, antibody test, crossmatching, PRA, DSA ...)

* HLA 검사의 분류

 HLA typing (형별 검사)

  Serologic typing (혈청학적 검사)

  Molecular typing / Genotyping (분자생물학적 검사)

  Cellular typing (세포학적 검사)

 HLA antibody test (항체 검사)

  HLA crossmatching (교차시험)

  PRA (panel reactive antibody)

  DSA (donor specific antibody. 공여자 특이 항체)

1. HLA typing

 혈청학적 검사법: HLA-A, B, C, DR, DQ 항원 검출 가능.

 DNA 검사법: 높은 민감도와 특이도, 소량의 검체 사용, 세포 생존도에 영향 받지 않는 장점.

 세포 반응을 이용한 검사법(cellular assay): HLA-D, DP 항원 검출에 이용되었으나 현재는 거의 사용되지 않고 HLA class II (DR, DQ, DP) 유전자의 고해상도(high resolution) DNA 검사법으로 대부분 대치됨.

 1) Serologic typing

 보체의존성 세포독성검사(complement-dependent cytotoxicity, CDC)에 기초한 미세림프구세포독성검사(microlymphocytotoxicity)가 이용되어 왔으나 분자생물학적 검사법으로 대체되는 추세.

 HLA 항혈청이 분주된 HLA 평판에 lymphocyte 부유액을 반응시키고 보체를 첨가하면 특정 HLA 항혈청에 반응하는 HLA 항원 존재 시 항원-항체 반응이 일어나고 보체결합반응에 의해 세포가 융해됨.

 Eosin Y 등으로 염색하여 역위위상차현미경(inverted phase contrast microscope)으로 판독하며 양성 반응을 보인 HLA 항체 특이성에 따라 HLA 항원을 결정.

 Eosin Y 염색법 외에 형광염색법 및 형광현미경을 이용한 판독도 가능.

 2) Molecular methods

 DNA 검사법의 경우 주로 PCR을 이용하여 검사할 HLA 유전자 부위를 증폭시킨 후 다음의 여러 가지 검사법을 이용하여 DNA typing

  (1) SSO (Sequence specific oligonucleotide) hybridization

  (2) Reverse SSO hybridization

  (3) SSP

  (4) RFLP (restriction fragment length polymorphism)

  (5) SSCP (sequence specific conformational polymorphism)

  (6) Direct sequencing

 상품화된 kit를 이용하는 reverse SSO, SSP가 널리 이용됨.

 대부분 저해상도~중등도 해상도 수준의 결과를 제공 (low~intermediate resolution)

 저해상도: 혈청학적 검사와 유사한 수준

 고해상도: allele 수준의 결과

 중등도 해상도: allele group의 결과

 직접염기서열분석법(direct sequencing): 고해상도. 최근 비혈연 조혈모세포 이식에서 이용.

 3) Cellular assays

 세포배양을 이용하여 HLA 항원의 차이를 검사하는 방법

 혼합림프구배양검사(mixed lymphocyte culture, MLC): HLA-D 항원을 검사. HLA 일배체형 동형접합체 세포(homozygous typing cell)를 이용한 반응으로 검사. 과거 장기이식에서 공여자와 환자의 HLA class II (DR, DQ, DP) 적합성을 평가하기 위해 사용되었으나 표준화가 어려워 최근에는 HLA class II에 대한 고해상도 DNA 검사법을 많이 이용.

2. HLA antibody test

 장기이식 대상자는 수혈, 임신, 또는 이전의 이식을 통해 타인의 HLA 항원에 감작되어 HLA 항체를 갖고 있을 수 있다.

 1) HLA crossmatching (교차시험)

 환자 혈액 내에 공여자의 HLA 항원에 반응하는 항체가 존재하는가

 목적: 초급성거부반응방지, 면역학적 위험인자로 작용하는 항체 검출

 보체의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC): 공여자의 림프구와 환자의 혈청을 반응시키는 방법

  CDC 방법: NIH 기본 방법, Amos 방법(항원-항체 반응 후에 세척 과정 추가), long incubation 방법, anti-human globulin (AHG) 방법(주로 anti-kappa 사용) (뒤로 갈수록 예민)

 유세포분석법을 이용한 교차시험: CDC보다 예민, IgG/IgM 구별 가능, T/B cell 따로 분리하지 않아도 2/3 color 형광염색으로 구별 가능. pronase 처리를 통해 B cell에서 비특이적인 형광을 초래하는 세포 표면 Fc receptor를 제거하여 특이도 향상 가능.

 교차시험 - 직접 CDC법과 간접법으로 구분. 기관에 따라 다르나 대부분 직접 CDC법 외에 간접법 중에 하나를 추가로 검사.

  간접법: AHG-CDC, 유세포분석법

  직접 CDC법: 그 외

 검사에는 total lymphocyte를 사용할 수도 있으나 T/B cell 분리하여 각각 검사하는 것이 좋음.

 T cell 교차시험 양성이면 HLA class I (HLA-A, B, C)에 대한 항체가 있다는 의미.

  직접 CDC법에 의한 T cell 교차시험 양성: 초급성거부반응. 이식의 절대적 금기.

   (과거 양성, 현재 음성: 금기는 아니지만 이식신 손실 위험도 상승)

  유세포분석법으로 T cell 교차시험 양성: 재이식 환자와 감작력이 있는 일차이식 환자에서 조기 이식신 손실 증가.

 B cell 교차시험: 일부 기관에서 감작된 환자에서 시행.

  양성인 경우 이식의 절대 금기는 아니지만 이식의 위험인자로 작용. 특히 재이식 환자.

  B cell 교차시험으로 검출되는 항체: HLA class II (HLA-DR, DQ) 특이적 항체, 약한 class I (HLA-A, B, C) 특이적 항체, 비 HLA 항체(자가항체 등)

  양성인 경우 class I/II 항체를 구별하기 위해 혈청을 혈소판 흡착(class I 항체가 흡착되어 제거됨) 처리 후 공여자와 교차시험 하기도 함.

 * 자가항체: 교차시험 양성으로 나타나나 이식에 악영향을 주지 않으므로 구별 필요.

   자가교차시험으로 확인 가능(환자의 혈청을 자신의 세포와 반응)

   자가항체가 있는 경우 공여자와의 교차시험 시 자가항체를 제거하고 시행해야 함.

   자가항체는 IgM, 대부분의 HLA 특이 항체는 IgG이므로

   IgM 불활성화(열처리(63±1℃), S-S 결합 파괴 물질 처리(dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE)) 후 검사에서 음성이면 IgM 자가항체로 생각.

   HLA 특이 항체가 IgM일 수도 있으므로 이식 적합성 판단에 주의.

 감작된 과거력이 없는 환자: 가장 최근의 혈청으로 교차시험

 최근 수혈 등 감작의 위험성이 있는 환자: 수술 전 48시간 이내의 혈청으로 교차시험

 감작된 환자: 과거의 혈청 중 가장 높은 반응을 보인 혈청(peak serum)도 현재 혈청과 함께 검사

 2) PRA (panel reactive antibody)

 사체(deceised donor, DD)이식 대기 환자에서 혈청 내 HLA 항체를 검출하고 그 특이성을 동정하기 위해 실시

 환자의 혈청을, HLA 항원 정보를 아는 수십명의 lymphocyte로 구성된 panel과 반응시킴

 양성인 경우 lymphocyte panel 중 몇 %에 반응하는가(%PRA)와 HLA 항체 특이성을 판정하여 보고

 * PRA 검사의 목적

  (1) 환자가 HLA 항원에 감작된 정도(%PRA)를 파악함으로써 교차시험 적합 공여자를 만날 수 있는 가능성과 장기이식 대기시간을 예측

  (2) HLA 항체 특이성을 동정함으로써 공여자 선정에서 피해야 하는 HLA 항원을 파악

  (3) 장기이식과 무관한 항체(IgM 자가항체 등)를 알아냄으로써 공여자와 교차시험 시 위양성 결과를 내지 않도록 적절한 교차시험방법을 선택하게 함

 PRA는 전통적으로 30~60명의 lymphocyte로 구성된 panel (인종의 HLA 항원 분포에 적합한 panel을 구성)을 이용하여 CDC법으로 검사

 최근에 사용되는 방법

  상품화된 solid-phase immunoassay kit로 가용성 HLA 항원을 플레이트에 부착시켜 효소면역측정법으로 검사

  bead에 부착시켜 유세포분석법(flow PRA)과 Luminex로 검사

 * Luminex 기법

   Polystyrene bead에 2가지의 형광 염료를 서로 다른 비율로 착색하여 이론적으로 100종까지의 bead population을 감별할 수 있음.

   환자의 혈청에 존재하는 HLA 항체를 bead에 부착되어 있는 HLA 항원과 결합시킨 후 phycoerythrin (PE) 표지된 항글로불린항체와 반응시킴

   이를 레이저로 검출하여 HLA 항체 유무를 판정

 * Bead에 부착시키는 항원 종류에 따라 3가지로 분류

   (1) Pooled antigen panel. 2개 이상의 bead population에 많은 수의 lymphocyte cell line에서 추출한 affinity-purified HLA 단백을 부착. HLA 항체 선별검사로 사용.

   (2) Phenotype panel. 수십 개의 bead population 각각에 하나의 lymphocyte cell line에서 추출한 HLA 단백을 부착. HLA 항체 동정검사로 사용.

   (3) Single-antigen bead. 수십 개의 bead population에 하나의 allele에서 cloning된 HLA 단백을 부착. 정확한 HLA 항체 동정 가능.

 * 상품화된 solid-phase immunoassay

   손쉽고 민감도 우수, IgG 항체나 HLA class I, II 특이 항체만을 검출하도록 되어 있는 장점.

   국내 환자에게 적용하는 데에 있어서 HLA 항원(panel) 구성의 문제점.

 * CREG (cross-reactive group)

   HLA 항체 특이성 동정에 있어서는, 신장이식 대기환자에서 HLA 개별 항원에 대한 항체보다는 CREG 항체를 갖고 있는 경우가 흔하므로, 이러한 CREG 항체를 잘 규명할 수 있어야 함.

 3) Donor specific antibody (DSA. 공여자 특이 항체)

 공여자의 HLA 항원에 특이적으로 반응하는 항체가 환자 혈액에 존재하는가

 PRA phenotype panel 또는 single-antigen bead를 통해 항체 특이성을 동정하여 판정

 * 다른 방법

   HLA 항체가 고형상의 플레이트나 bead에 포획(capture) 항체로 부착

   공여자의 lymphocyte 용해질(lysate)과 반응시켜 공여자 HLA 항원을 결합시킴

   여기에 환자 혈청을 반응시켜 공여자 HLA 항원에 결합한 공여자 특이 항체를 효소면역측정법, 유세포분석법, Luminex 검사법 등으로 검출

   상품화된 kit 존재

진단검사의학 제 5판. p782-5.